Методы получения генов
Для того чтобы создать рекомбинантную молекулу, сначала нужно получить интересующий фрагмент в достаточном объёме. Это можно сделать двумя основными путями:
- Обратная транскрипция. Используются ферменты ретровирусов — обратные транскриптазы. Они способны катализировать синтез молекулы ДНК, используя в качестве матрицы мРНК.
- Химический синтез. Применяются автоматические синтезаторы, которые создают одноцепочечные ДНК с заданной последовательностью. Главное ограничение этого метода — длина фрагмента не должна превышать 100 нуклеотидов.
Роль рестриктаз
Рестриктазы (эндонуклеазы) — это ферменты бактериального происхождения, выполняющие роль молекулярных «ножниц». Их главная функция — узнавать короткие специфические последовательности нуклеотидов (сайты рестрикции) и расщеплять в этих местах обе нити ДНК.
Существуют сотни разновидностей рестриктаз, каждая из которых специфична к определённому сайту. При разрезании могут формироваться концы двух типов:
- «Тупые» концы — фермент разрезает обе цепи строго друг напротив друга.
- «Липкие» концы — разрез происходит со смещением. В результате образуются одноцепочечные участки, способные по принципу комплементарности связываться с другими фрагментами.
Этапы создания рекомбинантной ДНК
Синтез гибридной молекулы базируется на использовании рестриктаз, образующих «липкие» концы (например, Eco RI). Процесс включает следующие шаги:
- Подготовка. Целевой ген и векторная ДНК (например, бактериальная плазмида или ДНК вируса) разрезаются одной и той же рестриктазой. Это необходимо для формирования идентичных комплементарных «липких» концов у обеих молекул.
- Гибридизация (отжиг). Одноцепочечные хвосты разных фрагментов спариваются между собой благодаря комплементарности азотистых оснований.
- Лигирование. Фермент ДНК-лигаза ковалентно сшивает фрагменты, полностью восстанавливая сахарофосфатный остов. На выходе получается готовая рекомбинантная ДНК.
Коротко: ответы на вопросы по теме
Какие молекулы используются в качестве векторов для создания рекомбинантной ДНК?
В качестве векторов для создания рекомбинантной ДНК используются следующие молекулы:
- Плазмиды — бактериальные экстрахромосомные кольцевые ДНК.
- ДНК бактериофага или вируса.
Векторы необходимы для внесения чужеродного гена в бактерию и обеспечения репликации, транскрипции и трансляции внесенного гена.
Помимо обратной транскрипции и химического синтеза, какие еще методы применяются для получения целевых генов?
Помимо обратной транскрипции и химического синтеза, для получения целевых генов применяются методы выделения (клонирования) природных генов:
- Изоляция генетических структур целиком (хромосомы, плазмиды).
- Ферментативное выщепление — использование рестриктаз, разрезающих ДНК по строго определенным связям.
- Расщепление РНК — использование рибозимов, действующих на РНК аналогично рестриктазам.
Для запоминания типов концов при рестрикции: «Тупой» рубит прямо (без выступов), а «Липкий» — со сдвигом, оставляя хвост, чтобы «прилипнуть» к соседу.
Вопросы с занятий и экзамена
Какие ферменты синтезируют ДНК на матрице мРНК?
Эту реакцию катализируют обратные транскриптазы (ферменты ретровирусов).
Чем отличаются «тупые» концы от «липких»?
При образовании «тупых» концов цепи ДНК разрезаются строго друг напротив друга, а при формировании «липких» — со смещением, что дает одноцепочечные комплементарные хвосты.
Какой фермент сшивает фрагменты ДНК?
Ковалентное соединение фрагментов и восстановление сахарофосфатного остова осуществляет ДНК-лигаза.
Что ещё разобрать по теме
- Механизм работы фермента Eco RI
- Процесс молекулярного клонирования в бактериальных клетках
- Специфичность сайтов рестрикции
- Векторные системы: плазмиды, бактериофаги, вирусы
Разберите тему целиком в курсе «Биохимия»
Здесь — выжимка. В курсе — всё, что спрашивают на занятии и экзамене.
- Полная методичка по теме «Технология рекомбинантных ДНК» и ещё 3 574 страниц предмета
- Задания и тесты после каждой темы — как на коллоквиуме
- AI-тьютор ответит на вопрос по теме в любое время
- 115 видеоуроков по предмету
Другие темы раздела «Матричные биосинтезы»
Бесплатные видеоуроки: биохимияКороткие уроки с конспектами — без регистрации.
Материал подготовлен преподавателями Школы Сеченова по учебной программе медицинских вузов. Носит образовательный характер.