Векторы и подготовка генов
Для переноса чужеродного генетического материала в бактерию требуются специальные молекулы-переносчики — векторы. Чаще всего в их роли выступают бактериофаги или плазмиды (бактериальные экстрахромосомные кольцевые молекулы ДНК).
Процесс начинается с подготовки вектора и донорского фрагмента ДНК, содержащего целевой ген. Обе молекулы обрабатывают одним и тем же ферментом — рестриктазой. Это необходимо, чтобы разрезать кольцевую плазмиду по специфическому сайту рестрикции и получить линейный фрагмент донорской ДНК с идентичными комплементарными («липкими») концами, которые готовы к объединению.
Основные этапы клонирования
Процедура создания и внедрения рекомбинантной молекулы включает несколько строгих последовательных шагов:
- Лигирование. Ранее подготовленная линеаризованная плазмида и фрагмент чужеродной ДНК сшиваются вместе. В результате формируется химерная плазмида (рекомбинантная ДНК), объединяющая генетический материал вектора и вставку.
- Трансформация. Химерную молекулу внедряют в клетку-хозяина (бактерию). Теперь внутри бактериальной клетки находится не только её собственная хромосома (нуклеоид), но и новая введенная плазмида.
- Селекция (скрининг). Необходимо идентифицировать и отобрать только те бактерии, которые успешно захватили рекомбинантную ДНК. Для этого используют гены устойчивости к антибиотикам, которые изначально содержатся в плазмиде.
- Культивирование. Выжившие отобранные бактерии активно размножаются на питательной среде. При делении клеток происходит репликация плазмид, то есть непосредственное клонирование встроенного фрагмента ДНК.
Два направления использования клеток
После успешного выращивания культуры бактерий дальнейшие действия разделяются на два направления в зависимости от конечной цели эксперимента:
- Амплификация (получение ДНК). Если исследователю нужен сам клонированный ген, рекомбинантные плазмиды выделяют из накопленной бактериальной биомассы. Затем их снова обрабатывают той же рестриктазой для вырезания вставки и проводят очистку целевого фрагмента. Итог — получение огромного количества копий нужной молекулы ДНК.
- Экспрессия (получение белка). Если нужен продукт гена, рост культуры бактерий обеспечивают в специфических условиях, которые стимулируют транскрипцию и трансляцию клонированного гена. Клетки активно нарабатывают целевой белок, после чего их разрушают, а готовый белковый продукт тщательно очищают.
Практическое применение технологии
Механизм использования рекомбинантных ДНК совершил революцию в медицине, биологии и фармакологии. Основные направления применения включают:
- Использование микроорганизмов как продуцентов. Бактерии синтезируют жизненно важные для человека вещества: белковые гормоны (инсулин, гормон роста, соматостатин), биологически активные пептиды, вакцины (например, против гепатита C) и факторы свертывания крови (фактор VIII для лечения гемофилии).
- Генную терапию. Лечение тяжелых наследственных болезней путем введения в организм нормальных копий дефектных генов.
- Селекцию. Создание принципиально новых генетических форм растений и животных с заданными полезными свойствами.
Коротко: ответы на вопросы по теме
Какой фермент осуществляет сшивание плазмиды и фрагмента чужеродной ДНК на этапе лигирования?
Сшивание плазмиды и фрагмента чужеродной ДНК осуществляет фермент ДНК-лигаза. Этот фермент ковалентно соединяет фрагменты путем восстановления фосфодиэфирных связей между соседними нуклеотидами.
В результате данного процесса восстанавливается целостность сахарофосфатного остова молекулы и образуется рекомбинантная (гибридная) ДНК. Выделяют следующие способы сшивания фрагментов:
- По «липким» концам — за счет образования водородных связей между однонитевыми участками комплементарных нуклеотидов.
- С помощью искусственно достроенных «липких» концов.
- По «тупым» концам.
Какие существуют типы рестриктаз, применяемых в генной инженерии?
В генетической инженерии используется около 200 рестриктаз (рестрикционных эндонуклеаз), которые классифицируются по типу разрезания молекулы ДНК.
| Тип разрезания | Механизм | Результат |
|---|---|---|
| По оси симметрии | Разрезание по оси симметрии узнаваемой последовательности | Образуются двухцепочечные «тупые» концы |
| Со сдвигом | Разрезание со сдвигом, с образованием «ступеньки» | Образуются «липкие» концы с взаимно комплементарными участками |
«Липкие» концы могут формироваться на 5'-конце (фосфатные) или на 3'-конце (гидроксильные).
Как запомнить базовую последовательность клонирования: РЛТСК (Рестрикция — Лигирование — Трансформация — Селекция — Культивирование). «Режут Ленту — Тянут Себе Копии».
Вопросы с занятий и экзамена
Зачем обрабатывать плазмиду и донорскую ДНК одной и той же рестриктазой?
Это необходимо для создания одинаковых «липких концов». Только в этом случае фрагмент донорской ДНК сможет идеально встроиться в разрезанную плазмиду по принципу комплементарности.
Как отделить бактерии с химерной плазмидой от клеток без нее?
С помощью селекции на антибиотиках. Плазмида несет ген устойчивости к препарату. При росте на среде с этим антибиотиком выживают лишь те бактерии, которые успешно захватили вектор.
В чем разница между амплификацией и экспрессией клонированного гена?
Амплификация направлена на получение множества копий самой молекулы ДНК. Экспрессия же подразумевает, что бактерия «прочитает» внедренный ген и синтезирует на его основе целевой белок.
Что ещё разобрать по теме
- Механизм действия эндонуклеаз рестрикции
- Фермент ДНК-лигаза и молекулярные основы лигирования
- Методы трансформации бактериальных клеток
- Принципы индукции экспрессии генов в бактериях
- Методы разрушения клеток и очистки рекомбинантных белков
Разберите тему целиком в курсе «Биохимия»
Здесь — выжимка. В курсе — всё, что спрашивают на занятии и экзамене.
- Полная методичка по теме «Клонирование ДНК» и ещё 3 574 страниц предмета
- Задания и тесты после каждой темы — как на коллоквиуме
- AI-тьютор ответит на вопрос по теме в любое время
- 115 видеоуроков по предмету
Другие темы раздела «Матричные биосинтезы»
Бесплатные видеоуроки: биохимияКороткие уроки с конспектами — без регистрации.
Материал подготовлен преподавателями Школы Сеченова по учебной программе медицинских вузов. Носит образовательный характер.