Иммунофенотипирование субпопуляций лимфоцитов
Идентификация клеток основана на выявлении специфических маркерных антигенов с использованием меченных флуорохромами антител.
- Т-лимфоциты: подсчет суммарной популяции осуществляется по моноклональным антителам к CD3 — абсолютному маркеру Т-клеток. Субпопуляции CD4+ и CD8+ выявляют параллельно с CD3, используя флуорохромы с контрастным свечением (зеленый, оранжевый, розовый), так как эти рецепторы могут экспрессироваться и на других клетках.
- В-лимфоциты: идентифицируются с помощью антител к CD19 (присутствует на всех В-клетках). Для оценки моноклональности при лимфопролиферативных процессах дополнительно исследуют мембранные $\kappa$- и $\lambda$-цепи.
Оценка пролиферативной активности и клеточного цикла
Функциональную способность Т-клеток оценивают по их поликлональному пролиферативному ответу на митогены. В современной практике для стимуляции используют моноклональные антитела к CD3 (соединенные с пластиком) в сочетании с растворимыми антителами к костимулирующей молекуле CD28.
Для измерения пролиферации и параметров клеточного цикла применяют следующие подходы:
- Проточная цитометрия с меткой CFSE: краситель Carboxyfluorescein succinyl ester связывается с белками внутри клетки и равномерно распределяется между дочерними структурами при митозе. На цитограмме крайний правый пик формируют неделившиеся клетки, а пики со смещением вправо-налево отражают популяции, прошедшие 1, 2, 3 и более делений.
- Радиоизотопный метод: измерение включения $^3$H-тимидина служит эталоном по чувствительности, однако связано с неудобствами использования радионуклидов.
- Оценка клеточного цикла: окрашивание пропидия йодидом с помощью специализированного ПО позволяет рассчитать долю клеток с гипердиплоидным содержанием ДНК в фазах G1+S, G2 и в митозе.
Лабораторная диагностика апоптоза
Анализ программной гибели лимфоцитов проводится двумя цитофлуориметрическими методами:
- Окрашивание пропидия йодидом: в ходе апоптоза теряется часть ядерного материала, поэтому гипнущие клетки образуют характерный гиподиплоидный пик, который на гистограмме располагается левее диплоидного.
- Связывание с аннексином V: меченый аннексин V селективно связывается с фосфатидилсерином, выходящим на наружную поверхность клеточной мембраны исключительно при апоптозе.
Функциональный анализ Т-хелперов (Th1 и Th2) и ELISPOT
Оценка способности Т-хелперов продуцировать цитокины требует внутриклеточного окрашивания и включает последовательные этапы:
- Активация: клетки стимулируют комбинацией форболмиристат ацетата (активатор протеинкиназы C) и иономицина (кальциевый ионофор) в обход антигенных рецепторов.
- Блокада секреции: краситель брефелдин А нарушает внутриклеточный транспорт в аппарате Гольджи, сохраняя цитокины внутри.
- Пермеабилизация и окрашивание: мембрану обрабатывают сапонином, после чего вводят антитела к цитокинам. Ключевой маркер Th1 — IFNγ, для Th2 — IL-4.
Для количественного учета секретирующих цитокины клеток (преимущественно IFNγ-продуцентов Th1) также применяется метод ELISPOT (Enzyme-linked immunospot). В нем клетки инкубируют на нитроцеллюлозной мембране с антителами, фиксируя выделяемый цитокин с помощью иммуноферментного анализа.
Коротко: ответы на вопросы по теме
На каких клетках иммунной системы, помимо Т-лимфоцитов, могут экспрессироваться рецепторы CD4 и CD8?
Помимо Т-лимфоцитов, рецепторы CD4 и CD8 могут экспрессироваться на макрофагах и дендритных клетках.
- CD4 — в небольшом количестве присутствует на некоторых макрофагах, что делает их чувствительными к инфицированию вирусом иммунодефицита человека.
- CD8 — используется для анализа субпопуляций у мышей и маркирует значительную часть лимфоидных дендритных клеток.
В чем заключается принцип визуализации и количественного учета секретирующих клеток в методе ELISPOT?
Принцип визуализации и учета в методе ELISPOT основан на иммуноферментном выявлении локально секретированного цитокина.
- Визуализация — секретируемый клеткой цитокин связывается с антителами, фиксированными на нитроцеллюлозной мембране. Образовавшийся комплекс выявляют с помощью вторичных антител, меченных пероксидазой, что приводит к образованию окрашенных пятен.
- Количественный учет — осуществляется путем подсчета образовавшихся окрашенных пятен с помощью микроскопа или специального прибора. Каждое пятно соответствует одной клетке, секретирующей исследуемый цитокин.
Какие поверхностные дифференцировочные антигены используются в качестве маркеров ранней и поздней активации Т-лимфоцитов?
В качестве маркеров активации Т-лимфоцитов используются следующие поверхностные антигены:
- CD69 — самый ранний активационный антиген, появляющийся на поверхности через 2–3 часа.
- CD25 — ранний маркер активации, представляющий собой $\alpha$-цепь рецептора для интерлейкина-2 (появляется через 4 часа).
- CD71 — маркер промежуточного этапа, рецептор для трансферрина (экспрессируется через 24 часа).
- MHC-II — поздние маркеры активации Т-клеток, экспрессия которых начинается на 3–6 сутки.
Также на позднем этапе (4–8 суток) появляются молекулы адгезии — $\beta_1$-интегрины.
CD3 — ВСЕ Т-клетки; CD19 — ВСЕ В-клетки; CFSE — считает деления справа налево; Аннексин V — ищет фосфатидилсерин при апоптозе.
Вопросы с занятий и экзамена
Почему CD4 и CD8 выявляют только совместно с CD3?
Молекулы CD4 и CD8 могут экспрессироваться не только на Т-лимфоцитах. Чтобы точно идентифицировать субпопуляции Т-клеток, их окрашивают параллельно с CD3 с помощью контрастных флуорохромов.
Как трактовать график цитометрии при использовании красителя CFSE?
Крайний правый пик с наибольшей интенсивностью флуоресценции обозначает неделившиеся клетки. Каждая следующая пиковая вершина влево соответствует клеткам, прошедшим 1, 2, 3 и более циклов деления.
Зачем при анализе цитокинов применяют брефелдин А и сапонин?
Брефелдин А блокирует транспорт веществ через аппарат Гольджи и предотвращает секрецию цитокинов наружу. Сапонин обеспечивает пермеабилизацию мембраны, позволяя антителам проникнуть внутрь клетки.
Что ещё разобрать по теме
- Использование мембранных kappa- и lambda-цепей для оценки моноклональности В-клеток
- Сравнительный анализ радиоизотопного метода (3H-тимидин) и метки CFSE
- Оценка реактивности клеточных клонов в тесте торможения миграции лейкоцитов
- Детальный алгоритм проведения и детекции результатов метода ELISPOT
Разберите тему целиком в курсе «Иммунология»
Здесь — выжимка. В курсе — всё, что спрашивают на занятии и экзамене.
- Полная методичка по теме «Проточная цитофлуориметрия» и ещё 723 страниц предмета
- Задания и тесты после каждой темы — как на коллоквиуме
- AI-тьютор ответит на вопрос по теме в любое время
- 23 видеоуроков по предмету
Другие темы раздела «Иммунитет в защите и повреждении организма. Патология иммунитета»
Материал подготовлен преподавателями Школы Сеченова по учебной программе медицинских вузов. Носит образовательный характер.