Иммуноферментный анализ сыворотки крови
Измерение уровня цитокинов в сыворотке крови с помощью классического иммуноферментного анализа (ИФА) считается недостаточно адекватным подходом.
Главный недостаток метода заключается в том, что он не позволяет разграничить процессы выработки (секреции) цитокинов и их потребления тканями. Кроме того, по концентрации цитокина в крови невозможно установить, какие именно клетки послужили источником его синтеза.
Метод ELISPOT
Более точным методом оценки секреции цитокинов на клеточном уровне является ELISPOT.
- Принцип действия: Цитокин (например, интерферон-гамма, IFNγ), секретируемый конкретной клеткой, улавливается специфическими антителами, фиксированными на подложке.
- Детекция: Образовавшийся комплекс «антитело-цитокин» выявляется с помощью вторых антител, которые помечены ферментом (пероксидазой).
- Учет результатов: С помощью микроскопа или специализированного ридера подсчитываются окрашенные пятна. Каждое пятно (спот) соответствует одной клетке, активно секретирующей исследуемый цитокин.
Этот метод нашел широкое применение в научных исследованиях, в частности, для поиска и отбора Т-клеточных эпитопов в процессе создания новых вакцин.
Коротко: ответы на вопросы по теме
Какие еще методы, кроме ИФА и ELISPOT, используются для оценки цитокинового статуса?
В приведённых источниках упомянуты следующие методы:
- Внутриклеточное окрашивание цитокинов — применяется для оценки способности Т-хелперов продуцировать специфические цитокины; исследование проводят методом проточной цитофлуориметрии после стимуляции форболмиристат ацетатом и иономицином.
- Количественная ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией — применяется для оценки уровня экспрессии генов, в том числе кодирующих иммунологически значимые молекулы.
- IGRA-тесты — основаны на высвобождении ИФН-γ под воздействием специфических туберкулезных антигенов; к ним относятся, например, QuantiFERON-TB Gold и T-SPOT.TB.
Какие конкретно клетки иммунной системы исследуют методом ELISPOT?
Методом ELISPOT выявляют клетки, секретирующие цитокин, в частности Т-клетки; метод широко используется для отбора Т-клеточных эпитопов при разработке вакцин. Теоретически ELISPOT можно применять для оценки антителообразующей способности В-клеток, однако индукция антителообразования in vitro крайне затруднительна.
Чем ELISPOT отличается от внутриклеточного окрашивания цитокинов при проточной цитофлуориметрии?
Основное отличие заключается в локализации выявляемых цитокинов и способе детекции результатов.
| Характеристика | ELISPOT | Внутриклеточное окрашивание |
|---|---|---|
| Локализация цитокинов | Секретируемые клеткой во внеклеточную среду | Внутриклеточное расположение |
| Принцип детекции | Связывание с фиксированными антителами на твердой фазе | Окрашивание после стимуляции форболмиристат ацетатом и иономицином |
| Учет результатов | Подсчет окрашенных пятен микроскопом или прибором | Проточная цитофлуориметрия |
Вопросы с занятий и экзамена
Почему ИФА сыворотки считается плохим методом для оценки цитокинов?
ИФА определяет лишь общий уровень цитокина в крови, не позволяя отличить его секрецию от потребления и не указывая на клеточный источник.
Что показывает одно окрашенное пятно в тесте ELISPOT?
Одно пятно соответствует ровно одной клетке, которая выделила исследуемый цитокин.
Что ещё разобрать по теме
- Оценка функциональной активности NK-клеток (радиометрические методы и экспрессия CD107)
- Оценка состояния системы комплемента (ИФА компонента С3)
- Оценка функции цитотоксических Т-лимфоцитов
- Оценка пролиферативного потенциала В-лимфоцитов (ответ на митоген лаконоса)
- Тесты in vivo в иммунодиагностике
Разберите тему целиком в курсе «Иммунология»
Здесь — выжимка. В курсе — всё, что спрашивают на занятии и экзамене.
- Полная методичка по теме «Определение секреции цитокинов» и ещё 723 страниц предмета
- Задания и тесты после каждой темы — как на коллоквиуме
- AI-тьютор ответит на вопрос по теме в любое время
- 23 видеоуроков по предмету
Другие темы раздела «Иммунитет в защите и повреждении организма. Патология иммунитета»
Материал подготовлен преподавателями Школы Сеченова по учебной программе медицинских вузов. Носит образовательный характер.