Факторы растворимости и электрический заряд
Способность белков растворяться в воде зависит как от их собственных характеристик (соотношение полярных и неполярных радикалов, устойчивость к денатурации), так и от параметров среды: температуры, солевого состава, наличия органических веществ и показателя кислотности (pH).
Ключевую роль играет суммарный заряд молекулы. Он формируется за счет ионизированных групп аминокислот — отрицательных карбоксильных и положительных аминогрупп. Изменение pH среды сдвигает этот баланс:
- В кислой среде (при избытке протонов водорода) подавляется диссоциация карбоксильных групп. Белок теряет отрицательные заряды и становится более положительным.
- В щелочной среде (при избытке гидроксил-ионов) протоны отрываются от аминогрупп, превращая их в нейтральные. В результате белок теряет положительный заряд и становится более отрицательным.
Изоэлектрическая точка (ИЭТ)
Существует определенное значение pH, при котором количество положительно и отрицательно заряженных групп в молекуле белка уравнивается. Это состояние называется изоэлектрической точкой.
В изоэлектрическом состоянии суммарный заряд белка равен нулю. В результате исчезают силы электростатического отталкивания между молекулами, они начинают слипаться друг с другом (агрегировать) и выпадают в осадок. Именно в ИЭТ растворимость белка минимальна.
Яркий пример этого процесса — сворачивание молока. В свежем молоке молекулы белка казеина заряжены отрицательно и образуют устойчивый коллоидный раствор. При размножении бактерий выделяется молочная кислота, которая снижает pH. Когда кислотность достигает изоэлектрической точки казеина (около 4,6), его заряд нейтрализуется, молекулы перестают отталкиваться и молоко сворачивается.
Принципы выделения и очистки белков
Для изучения свойств конкретного белка его необходимо извлечь из клеток и очистить. Стандартный алгоритм включает несколько этапов:
- Разрушение клеток для получения гомогената.
- Фракционирование (центрифугирование) — разделение смеси на ядерную, митохондриальную, цитозольную и другие фракции, чтобы выделить ту, где находится искомый белок.
- Избирательная тепловая денатурация — кратковременное нагревание. Если нужный белок термостабилен, то нагрев заставит термолабильные примеси денатурировать и выпасть в осадок, оставив целевой белок в растворе.
- Высаливание — добавление солей (чаще всего сульфата аммония). Белки с наименьшей растворимостью выпадают в осадок при низких концентрациях соли. Постепенно повышая концентрацию, можно разделить смесь на отдельные фракции.
Разделение белков по массе
Для разделения макромолекул в зависимости от их размера и веса применяют ультрацентрифугирование, электрофорез в полиакриламидном геле и гель-фильтрацию (молекулярно-ситовую хроматографию).
Принцип гель-фильтрации основан на пропускании смеси через колонку с пористыми гранулами. Крупные белки физически не могут проникнуть в поры геля; они проходят в свободном пространстве между гранулами и вымываются из колонки первыми. Мелкие молекулы проникают внутрь пор, их путь сильно удлиняется, поэтому они покидают колонку последними.
Другой важный метод — электрофорез на бумаге, разделяющий белки в электрическом поле. В сыворотке крови здорового человека быстрее всего к аноду движутся альбумины (самая большая фракция, 54–58%). За ними следуют глобулины (альфа-1, альфа-2 и бета). Самой низкой подвижностью обладают гамма-глобулины, образующие катодную фракцию.
Коротко: ответы на вопросы по теме
Какие соли помимо сульфата аммония применяют для высаливания белков?
Для высаливания белков, помимо сульфата аммония, применяют сульфат натрия и хлорид натрия.
Высаливание — это обратимое осаждение белка из раствора с помощью высоких концентраций нейтральных солей. Ионы соли гидратируются, отнимая воду у белковых молекул и нейтрализуя их заряд, что приводит к агрегации и выпадению белков в осадок.
Какими химическими реагентами проводят необратимое осаждение белков?
Необратимое осаждение (денатурацию) белков проводят следующими химическими реагентами:
- Кислоты и щёлочи — изменяют ионизацию ионогенных групп, разрывая ионные и водородные связи.
- Органические растворители (спирт, фенол, хлорамин) — разрушают гидрофобные взаимодействия и водородные связи.
- Соли тяжёлых металлов — образуют нерастворимые соли белков.
- Мочевина — разрушает внутримолекулярные водородные связи.
- Детергенты.
Чем обусловлены буферные свойства растворов белков?
Буферные свойства растворов белков обусловлены наличием в их молекулах амино- и карбоксильных групп, которые могут выступать в роли кислот и оснований.
Состав белковой буферной системы включает молекулу белка (NH₂-Prot-COOH) и её соль (NH₂-Prot-COONa). При поступлении кислоты белок связывает протоны, а при поступлении оснований — отдает протоны, тем самым поддерживая pH среды. Буферная емкость белков по кислоте больше, чем по щелочи.
Какие виды химических связей разрушаются при тепловой денатурации белка?
При тепловой денатурации белка разрушаются слабые связи, стабилизирующие его третичную и вторичную структуру.
К таким связям относятся:
- Водородные связи.
- Гидрофобные взаимодействия.
- Ионные связи.
Разрушение этих связей происходит из-за усиления хаотичного движения молекул при высоких температурах (свыше 60°C), при этом пептидные связи (первичная структура) сохраняются.
Чтобы не путать результаты гель-фильтрации, представьте, что гранулы геля — это дома с узкими дверями. «Толстые» (крупные) молекулы не могут зайти в дом, поэтому быстро пробегают по улице и приходят к финишу первыми. «Худые» (мелкие) молекулы заходят в каждую дверь, долго блуждают по комнатам и приходят последними.
Вопросы с занятий и экзамена
Почему денатурированный белок легче выпадает в осадок?
При денатурации нарушается пространственная структура молекулы, и гидрофобные радикалы аминокислот, которые в норме спрятаны внутри, оказываются на поверхности. Это резко снижает растворимость белка в воде.
Какое значение pH нужно создать, чтобы пептид с зарядом -1 достиг изоэлектрической точки?
Так как заряд пептида отрицательный, его нужно нейтрализовать путем добавления протонов (положительных зарядов). Для этого среду необходимо подкислить, то есть ИЭТ будет находиться в кислой среде (pH < 7).
Что произойдет с зарядом белка при добавлении щелочи?
В щелочной среде присутствует избыток гидроксид-ионов. Они связывают протоны, отнимая их у аминогрупп. В результате положительный заряд белка снижается, и он становится более отрицательным.
Что ещё разобрать по теме
- Правила расчета суммарного заряда пептида по аминокислотным остаткам
- Протеинограмма здорового человека: процентное соотношение фракций
- Принципы электрофореза в полиакриламидном геле (в присутствии ДСН)
- Молекулярные механизмы обратимого высаливания белков
Разберите тему целиком в курсе «Биохимия»
Здесь — выжимка. В курсе — всё, что спрашивают на занятии и экзамене.
- Полная методичка по теме «Физико-химические свойства белков» и ещё 3 574 страниц предмета
- Задания и тесты после каждой темы — как на коллоквиуме
- AI-тьютор ответит на вопрос по теме в любое время
- 115 видеоуроков по предмету
Другие темы раздела «Строение, свойства и функции белков»
Бесплатные видеоуроки: биохимияКороткие уроки с конспектами — без регистрации.
Материал подготовлен преподавателями Школы Сеченова по учебной программе медицинских вузов. Носит образовательный характер.