Принципы диагностики и забор материала
Глобально лабораторная диагностика гриппа развивается в трех основных направлениях:
- Выделение и последующая идентификация самого вируса.
- Индикация вирусных антигенов или молекул РНК непосредственно в клетках.
- Серологическое исследование, направленное на поиск специфических антител.
Для успешного выявления возбудителя критически важно правильно собрать клинический материал. Оптимальным сроком для взятия отделяемого носоглотки (в виде мазков или смывов) и мазков-отпечатков со слизистой оболочки носа являются первые три дня от начала заболевания. Именно в этот период концентрация вирусных частиц на слизистых оболочках достигает максимума.
Экспресс-диагностика и молекулярно-генетический метод
Если врачу требуется быстро получить предварительные данные, применяются методы экспресс-диагностики. Их главная мишень — структурные вирусные антигены в собранном биоматериале. Для их визуализации и обнаружения лаборатории используют реакцию иммунофлюоресценции (РИФ, как в прямом, так и в непрямом варианте), а также иммуноферментный анализ (ИФА).
Молекулярно-генетический метод ставит своей целью прямое выявление генетического аппарата возбудителя. Поскольку геном данного инфекционного агента представлен цепочкой РНК, основным инструментом поиска выступает полимеразная цепная реакция (ПЦР) с этапом обратной транскрипции. Этот подход позволяет с высочайшей точностью обнаружить вирусную РНК в клинических пробах.
Вирусологический метод («Золотой стандарт»)
Классическое выделение вируса считается эталонным, но наиболее сложным подходом. Он строго разделен на три последовательных этапа:
- Культивирование (накопление). Для размножения вируса необходимы живые биологические системы. В лабораторной практике используют развивающиеся куриные эмбрионы, лабораторных животных или культуры клеток. К последним относятся первичные культуры клеток почек обезьян, макак-резус или собак.
- Индикация. На этом этапе подтверждается сам факт размножения вируса в системе. В культурах клеток о присутствии возбудителя говорит развитие цитопатического эффекта (ЦПЭ), формирование специфических «бляшек» или изменение цвета среды в «цветной пробе». При использовании животных судят по их гибели или характерным клинико-патоморфологическим изменениям. Также факт репродукции подтверждают по свойствам самого вируса, применяя реакции гемагглютинации (РГА) и гемадсорбции.
- Идентификация. Финальный шаг — определение конкретного вида и типа выделенного агента. Эта процедура базируется на детальном изучении его антигенной структуры. С этой целью ставят реакции связывания комплемента (РСК), торможения гемагглютинации (РТГА), биологической нейтрализации (РБН) и ИФА.
Серологический метод
В отличие от генетического или вирусологического поиска, серологический метод оценивает не самого возбудителя, а реакцию иммунной системы пациента.
Фундаментальный принцип метода заключается в исследовании парных сывороток крови. Первую порцию крови забирают в самом начале болезни, а вторую — спустя 10–14 дней. Строгим критерием подтверждения диагноза является минимум четырехкратное нарастание титра антител во второй сыворотке по сравнению с первой.
Для оценки уровня антител применяются различные реакции: РТГА, РСК, ИФА и реакция нейтрализации (РН). Из-за необходимости длительного ожидания второй порции сыворотки этот метод не подходит для раннего выявления болезни. Он имеет преимущественно ретроспективное значение, позволяя достоверно подтвердить диагноз уже после перенесенного эпизода инфекции.
Коротко: ответы на вопросы по теме
Какие поверхностные гликопротеины вируса гриппа являются основными антигенами для определения его подтипа?
Основными поверхностными антигенами вируса гриппа, определяющими его подтип, являются гемагглютинин и нейраминидаза.
- Гемагглютинин (HA) — отвечает за адсорбцию и слияние вируса с клеткой.
- Нейраминидаза (NA) — удаляет остатки сиаловой кислоты с гемагглютинина, что необходимо для проявления инфекционных свойств.
Эти протективные антигены изменяются независимо друг от друга. Всего известно 15 подтипов HA и 9 подтипов NA, из которых для человека стабильно патогенны H1, H2, H3 и N1, N2.
Какие виды лабораторных животных наиболее чувствительны к вирусу гриппа и используются для его выделения?
В источниках указано, что для выделения вируса гриппа используют лабораторных животных, однако конкретные наиболее чувствительные виды не названы. В 1933 году вирус гриппа человека впервые выделили после заражения хорьков смывами из носоглотки. Размножение вируса у заражённых животных выявляют по их гибели или клинико-патоморфологическим изменениям.
В чем заключается механизм реакции гемадсорбции, используемой для индикации вируса гриппа?
Реакция гемадсорбции основана на изменении поверхностных свойств инфицированных клеток: заражённые вирусом гриппа клетки приобретают способность адсорбировать, то есть прикреплять, эритроциты на своей мембране. Метод позволяет выявить вирус даже при отсутствии видимого цитопатического действия. Для обнаружения вирусов, вышедших из клеток в культуральную жидкость, также можно использовать реакцию гемагглютинации.
Правило «четырех» для серологии: диагноз подтверждается только при четырехкратном нарастании титра антител в парных сыворотках, которые берут с интервалом около 14 (число оканчивается на 4) дней.
Вопросы с занятий и экзамена
Почему серологический метод не используют для экстренной диагностики?
Потому что для его проведения требуются парные сыворотки с интервалом забора в 10–14 дней. Этот метод предназначен для ретроспективного подтверждения диагноза, когда пациент уже выздоравливает.
Как доказывают факт размножения вируса в клеточной культуре?
Об этом судят на этапе индикации по развитию цитопатического эффекта, появлению «бляшек», изменениям в «цветной пробе», а также с помощью реакций гемагглютинации (РГА) и гемадсорбции.
Какой биологический материал лучше всего брать для поиска РНК вируса?
Оптимально использовать отделяемое носоглотки (смыв или мазок) и мазки-отпечатки со слизистой оболочки носа, собранные в первые 3 дня от начала болезни.
Что ещё разобрать по теме
- Механизм постановки ПЦР с обратной транскрипцией
- Принципы чтения результатов реакций гемагглютинации (РГА) и гемадсорбции
- Особенности культивирования вирусов на куриных эмбрионах
- Антигенная структура вирусов и ее роль на этапе идентификации
Разберите тему целиком в курсе «Микробиология»
Здесь — выжимка. В курсе — всё, что спрашивают на занятии и экзамене.
- Полная методичка по теме «Микробиологическая диагностика гриппа» и ещё 4 383 страниц предмета
- Задания и тесты после каждой темы — как на коллоквиуме
- AI-тьютор ответит на вопрос по теме в любое время
- 141 видеоуроков по предмету
Другие темы раздела «Ортомиксовирусы (грипп)»
Бесплатные видеоуроки: микробиологияКороткие уроки с конспектами — без регистрации.
Материал подготовлен преподавателями Школы Сеченова по учебной программе медицинских вузов. Носит образовательный характер.