Содержание · 12 разделов
- 1. История и автор
- 2. Методика (4 этапа)
- 3. Строение клеточной стенки
- 4. Грам+ бактерии — важнейшие
- 5. Грам− бактерии — важнейшие
- 6. «Не красятся по Граму»
- 7. Клиническое применение
- 8. Эмпирическая антибиотикотерапия
- 9. Ограничения метода
- 10. Ошибки исследования
- 11. Современные альтернативы и дополнения
- 12. FAQ
В двух словах. Окраска по Граму (1884, Ганс Христиан Грам) — базовый метод классификации бактерий: Грам+ окрашиваются в фиолетовый (толстая клеточная стенка с пептидогликаном удерживает комплекс «генциан-йод»), Грам− — в розовый (тонкий пептидогликан + внешняя мембрана с ЛПС, комплекс вымывается спиртом, докрашивается сафранином/фуксином). За 3–5 мин даёт ориентировку: Грам+ кокки — стафило/стрепто/энтерококки; Грам− палочки — кишечная группа, псевдомонады; Грам+ палочки — клостридии, листерии, бациллы; Грам− кокки — нейссерии. Критично для выбора эмпирической антибиотикотерапии до посева.
1. История и автор
- Разработан в 1884 г. датским микробиологом Гансом Христианом Грамом.
- Первоначально — для дифференцировки пневмококка от клебсиеллы в препаратах лёгких.
- С 1920-х — стандарт в медицинской микробиологии.
- Основан на различиях в строении клеточной стенки.
2. Методика (4 этапа)
| Этап | Реагент | Время | Результат |
|---|---|---|---|
| 1. Первичная окраска | Генциановый/кристаллический фиолетовый | 1 мин | Все клетки фиолетовые |
| 2. Протрава | Раствор Люголя (I₂-KI) | 1 мин | Формирование комплекса генциан-йод |
| 3. Обесцвечивание | 96 % этанол или ацетон | 15–30 сек | Грам− теряют краситель; Грам+ удерживают |
| 4. Докрашивание | Сафранин или фуксин Пфейффера | 1 мин | Грам− розовые; Грам+ остаются фиолетовыми |
- Между этапами — промывание дистиллированной водой.
- Критично: не передержать на этапе обесцвечивания → ложноотрицательные (Грам+ становятся розовыми).
- Материал — нативный (мокрота, моча, ликвор, раневое отделяемое) или с колоний на среде.
3. Строение клеточной стенки
Грам+ бактерии
- Толстый слой пептидогликана (20–80 нм).
- Тейхоевые и липотейхоевые кислоты.
- Нет внешней мембраны.
- Пептидогликан-йод-генциановый комплекс крупный, не вымывается спиртом.
- Чувствительны к пенициллинам, ванкомицину, лизоциму.
Грам− бактерии
- Тонкий слой пептидогликана (2–7 нм).
- Внешняя мембрана с липополисахаридом (ЛПС, эндотоксин) и порине.
- Периплазматическое пространство между двумя мембранами.
- При обработке спиртом липидный слой растворяется → комплекс вымывается.
- Устойчивы к ванкомицину (не проникает через внешнюю мембрану).
4. Грам+ бактерии — важнейшие
| Род | Вид | Форма | Заболевания |
|---|---|---|---|
| Staphylococcus | S. aureus | Грозди кокков | Пиодермии, сепсис, эндокардит, пневмония |
| Streptococcus | S. pyogenes (BGA) | Цепочки кокков | Ангина, скарлатина, рожа, острый гломерулонефрит |
| Streptococcus | S. pneumoniae | Диплококки ланцет. | Пневмония, менингит, отит |
| Enterococcus | E. faecalis | Диплококки | ИМП, эндокардит |
| Bacillus | B. anthracis | Палочки | Сибирская язва |
| Clostridium | C. difficile, tetani, botulinum, perfringens | Анаэроб. палочки | Псевдомембр. колит, столбняк, ботулизм, газовая гангрена |
| Listeria | L. monocytogenes | Палочки | Листериоз у беременных, новорождённых |
| Corynebacterium | C. diphtheriae | Палочки | Дифтерия |
5. Грам− бактерии — важнейшие
| Род | Представители | Заболевания |
|---|---|---|
| Enterobacteriaceae | E. coli, Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Serratia | ИМП, сепсис, пневмония, перитонит |
| Salmonella | S. typhi, S. enteritidis | Брюшной тиф, сальмонеллёз |
| Shigella | S. dysenteriae и др. | Шигеллёз |
| Pseudomonas | P. aeruginosa | Нозокомиальные инфекции, ВАП, ожоговые раны |
| Acinetobacter | A. baumannii | Нозокомиальные, MDR |
| Neisseria | N. meningitidis, N. gonorrhoeae | Менингит, гонорея |
| Haemophilus | H. influenzae | Эпиглоттит, менингит, отит |
| Bordetella | B. pertussis | Коклюш |
| Campylobacter | C. jejuni | Энтерит |
| Helicobacter | H. pylori | Гастрит, язва, рак желудка |
6. «Не красятся по Граму»
- Микобактерии (M. tuberculosis, M. leprae) — восковая стенка; окраска по Цилю-Нильсену (КУМ).
- Микоплазмы (M. pneumoniae) — нет клеточной стенки; не видны при Грам-окраске.
- Спирохеты (T. pallidum, Borrelia) — тонкие, плохо красятся; тёмнопольная микроскопия, серебрение.
- Хламидии, риккетсии — внутриклеточные паразиты.
- Legionella — требует серебрения или специальных сред (BCYE).
7. Клиническое применение
- Мокрота — быстрая ориентировка при внебольничной и нозокомиальной пневмонии.
- Ликвор — экстренно при менингите: Грам+ диплококки — пневмококк; Грам− диплококки — менингококк; Грам− палочки — H. influenzae.
- Моча — при уросепсисе; Грам− палочки — чаще кишечная группа.
- Кровь (из флаконов гемокультуры) — при сепсисе.
- Раневое отделяемое, гной.
- Мазок уретры/цервикса — гонорея (Грам− диплококки внутри нейтрофилов).
8. Эмпирическая антибиотикотерапия
- Грам+ кокки в мокроте у внебольничной пневмонии — цефтриаксон ± макролид; вероятен пневмококк.
- Грам− палочки в моче — цефтриаксон, фторхинолоны.
- Грам+ диплококки в ликворе — цефтриаксон + ванкомицин (пневмококк, возможна резистентность).
- Грам− диплококки в ликворе — цефтриаксон (менингококк); изоляция контактных.
- Смешанная флора в перитонеальном отделяемом — β-лактам + антианаэробный (метронидазол) или карбапенем.
- Анаэробные Грам+ палочки со спорами — заподозрить клостридиальную инфекцию.
9. Ограничения метода
- Чувствительность ~60–80 % (для достоверной оценки нужно ≥ 10⁵ клеток в поле зрения).
- Качество образца: в мокроте — контроль по критериям (< 10 эпителиальных клеток и > 25 нейтрофилов в поле при ×100).
- Не различает жизнеспособные и мёртвые клетки.
- Не даёт видовой диагноз (нужен посев + биохимия + масс-спектрометрия MALDI-TOF).
- Не заменяет чувствительность к антибиотикам — её определяют только после посева.
10. Ошибки исследования
- Передержка в спирте — ложноотрицательные (Грам+ выглядят как Грам−).
- Недодержка — ложноположительные.
- Старые культуры — Грам+ могут давать грамвариабельную картину (обусл. истончением стенки).
- Чрезмерно толстый мазок — плохое обесцвечивание.
- Контаминация — множество морфотипов.
11. Современные альтернативы и дополнения
- Посев с идентификацией через MALDI-TOF (масс-спектрометрия) — видовой диагноз за 15 мин.
- ПЦР-панели (Septi-Fast, FilmArray BCID/GI/RP) — быстрая детекция возбудителей в крови, ликворе, респ. материале.
- 16S rRNA-секвенирование — идентификация при отрицательном посеве.
- Антиген-тесты (пневмококковый, легионеллёзный в моче).
- Окраска по Граму остаётся первым скринингом из-за скорости и дешевизны.
12. FAQ
Почему микобактерии не красятся по Граму?
Их клеточная стенка содержит высокомолекулярные миколовые кислоты и воск → гидрофобная поверхность не пропускает водные красители. Используют кислотно-щёлочно-устойчивую окраску (Циль-Нильсен, флюорохром аурамин).
Грамвариабельные — это кто?
Бактерии, которые в разных условиях дают разную картину: старые Грам+ (истончение стенки), некоторые клостридии, листерии. Обычно соответствуют истинным Грам+.
Почему Грам− палочки в моче чаще всего — E. coli?
Кишечная палочка — нормальный комутабитант ЖКТ и основная причина внебольничных ИМП (70–80 %). Это первая гипотеза при появлении Грам− палочек в моче.
Можно ли по Граму различить S. aureus и S. epidermidis?
Нет. Оба — Грам+ кокки в гроздьях. Различают через коагулазу (S. aureus +), каталазу (оба +) и биохимию.
Почему ванкомицин не работает против Грам−?
Ванкомицин — крупная молекула, которая связывается с D-Ala-D-Ala в пептидогликане. У Грам− снаружи есть внешняя мембрана с малыми поринами, через которую ванкомицин не проникает.
Смотрите также: Антибиотики · Сепсис · Менингит · Туберкулёз · Каталог микробиологии